人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSC被廣泛用于疾病建模、藥物開發(fā)和疾病的細(xì)胞治療，隨著基因編輯技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，對疾病誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，校正致病基因的突變并用于細(xì)胞治療正成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。
CRISPR介導(dǎo)的基因編輯為研究人員提供了一種更快、更有效的方法來編輯細(xì)胞中感興趣的關(guān)鍵基因。雖然比傳統(tǒng)方法更有效，但基因組編輯過程通常會損害細(xì)胞活力，因此從編輯后的單細(xì)胞生長成到單克隆細(xì)胞團(tuán)是一個(gè)困難的過程。CRISPR工作流程的一個(gè)主要瓶頸是單細(xì)胞克隆。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，產(chǎn)生的細(xì)胞群是異質(zhì)的，具有不同程度的編輯。該群體必須從未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中富集并克隆以創(chuàng)建統(tǒng)一的單克隆細(xì)胞系，以便進(jìn)一步表征以確保進(jìn)行正確的基因編輯。此外，必須保證基因變化的安全性和可追溯性，特別是在使用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的醫(yī)療應(yīng)用中。這是歐洲藥品管理局 (EMA) 和食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 所要求的。
傳統(tǒng)的分選方法如有限稀釋法耗時(shí)耗力、效率低下；FACS分選的細(xì)胞容易受到鞘液壓力的影響而受損，導(dǎo)致單克隆率低。同時(shí)，這兩種方法都無法提供單細(xì)胞來源的證明，無法滿足監(jiān)管部門的要求。Cytena公司的單細(xì)胞打印機(jī)以噴墨式打印技術(shù)溫和而高效的分選單細(xì)胞，簡化了基因編輯工作流程，極大的提高了單克隆有效率。
下面小編將闡述Cytena的single cell printer分別如何提高iPSC的單克隆效率，如何簡化基因編輯的MSC的工作流程。
CRISPR基因編輯與人多能干細(xì)胞(hPSC)
iPSC是什么？
2006年，日本科學(xué)家Yamanaka及其研究小組利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，向鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，獲得在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等都與胚胎干細(xì)胞極為相似的細(xì)胞，后命名為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)。次年，該研究小組又成功將人體細(xì)胞重編程為iPSC，允許自我更新和分化成人體幾乎所有的細(xì)胞類型。
iPSC細(xì)胞研究改變了基礎(chǔ)研究的方向和趨勢，Yamanaka也因“將成熟細(xì)胞重新編程，轉(zhuǎn)化為可以分化為多種細(xì)胞類型的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)方面的杰出貢獻(xiàn)”成為2012年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎共同得主。
iPSC應(yīng)用領(lǐng)域及研究熱點(diǎn)
iPSC的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢是它們從人類的成體細(xì)胞產(chǎn)生，避免了人類胚胎干細(xì)胞的倫理爭議，在藥物發(fā)現(xiàn)、疾病建模、細(xì)胞治療中具有廣泛的應(yīng)用。為了進(jìn)一步發(fā)揮人iPSC的應(yīng)用潛能，通過CRISPR/Cas9基因編輯的方法，將疾病發(fā)生的突變引入iPSC，或通過iPSC修復(fù)疾病模型中的突變，再分化成不同的細(xì)胞進(jìn)行研究或治療，是目前iPSC的研究熱點(diǎn)1。
圖1：iPSC的研究熱點(diǎn)
Cytena單細(xì)胞打印機(jī)在CRISPR 基因編輯的hPSC單細(xì)胞分選中的應(yīng)用
hPSC對培養(yǎng)環(huán)境的變化十分敏感，如pH值、滲透壓、營養(yǎng)供應(yīng)、機(jī)械應(yīng)力/剪切力等。在傳統(tǒng)的培養(yǎng)條件下，hPSC通常在涂有各種細(xì)胞外基質(zhì)表面上密集生長。在對hPSC基因組編輯過程中，最大的挑戰(zhàn)之一是獲得陽性單克隆細(xì)胞。單個(gè)hPSC的生長過程中，減少了細(xì)胞和細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的接觸，容易誘發(fā)細(xì)胞失巢凋亡，導(dǎo)致單細(xì)胞存活率顯著下降。一方面，抑制細(xì)胞失巢凋亡的產(chǎn)生，會改善單細(xì)胞存活率；另一方面，溫和的自動化分選系統(tǒng)可以進(jìn)一步優(yōu)化陽性單克隆細(xì)胞的篩選平臺。
德國學(xué)者在Curr Protoc Stem Cell Biol上發(fā)表文章，分享使用Cytena單細(xì)胞打印機(jī)分選基因編輯后hPSC單細(xì)胞的流程，最終平均每個(gè)96孔板獲得30-50個(gè)單克隆hPSC2。
圖2：Cytena單細(xì)胞打印機(jī)篩選單克隆hPSC流程
21年5月，Nature Methods報(bào)道能顯著提高h(yuǎn)PSC在單細(xì)胞克隆過程中存活率的四組分配方CEPT。
相比于流式分選，Cytena單細(xì)胞打印機(jī)以更溫和的篩選技術(shù)極大提高了單細(xì)胞存活率；并利用單細(xì)胞打印機(jī)驗(yàn)證CEPT能夠提高不同來源hPSC細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染前后的單克隆細(xì)胞的存活率，且沒有引起遺傳異常3。
圖3：Cytena單細(xì)胞打印機(jī)驗(yàn)證CEPT提高單克隆hPSC活率
• 流式細(xì)胞儀和Cytena分選hPSC細(xì)胞比較。Cytena分選hPSC細(xì)胞過程中捕捉噴嘴圖片證實(shí)單細(xì)胞來源(圖3d)；比較小分子Y-27632與CEPT處理后hPSC的單克隆有效率，可以發(fā)現(xiàn)CEPT處理后克隆有效率更高(圖3b, 3c)；在相同小分子處理下，Cytena分選設(shè)備單克隆有效率(圖3c, 3d)比流式分選(圖3a, 3b)高出~20%。
• 后續(xù)的實(shí)驗(yàn)摸索均使用Cytena分選設(shè)備，證實(shí)CEPT可以明顯提高h(yuǎn)PSC單細(xì)胞克隆率(圖3e, 3f)；與 VN 相比，涂有LN521的并含有 StemFlex 培養(yǎng)基的 96 孔板中的hPSC單細(xì)胞生存得更好、遷移能力更強(qiáng)(圖3e, 3f, 3g)。
• 隨機(jī)選取CEPT處理后的單克隆，建系傳4代培養(yǎng)后，細(xì)胞核型檢測均正常，表明CEPT沒有引起遺傳異常(圖3h)。
• 同時(shí)，使用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因組編輯CEPT處理后的hPSC，發(fā)現(xiàn)其改善了電穿孔時(shí)的細(xì)胞存活率(圖3i-3l)。
Cytena單細(xì)胞打印機(jī)簡化生成CRISPR編輯的MSC克隆的工作流程
除了在hPSC的應(yīng)用外，Cytena單細(xì)胞打印機(jī)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被用于簡化生成 CRISPR 編輯的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)克隆的工作流程。
圖4：RANKL-KO MSCs工作流程
文獻(xiàn)4向我們展示了一種高效、高通量的工作流程(圖4)，該工作流程采用 f.sight™單細(xì)胞打印機(jī)，通過GFP報(bào)告基因，用于選擇和克隆 CRISPR/Cas9 編輯以敲除RANKL蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)，以進(jìn)一步增強(qiáng)MSCs在再生醫(yī)學(xué)中的治療能力。
圖5：Cytena單細(xì)胞打印機(jī)利用GFP簡化篩選陽性單克隆MSCs流程
f.sightTM的高靈敏度能夠檢測到編輯后的MSCs的低熒光信號并富集到編輯成功的帶綠色熒光信號的細(xì)胞(圖5A)，f.sightTM的單細(xì)胞分離效率高達(dá)93.9±2.7%(n=451)(圖5A)。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的間充質(zhì)干細(xì)胞(31.3±8%)和未轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞(39.6±15.6%)在成克隆率上差異較小，基因編輯過程通常會損害細(xì)胞活力，這也表明f.sight單細(xì)胞分選過程柔和，因此產(chǎn)生的系統(tǒng)偏差較小(圖5B)。
圖6：RANKL-KO MSCs增強(qiáng)成骨分化能力
CRISPR/Cas9編輯過的敲除RANKL蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞與野生型MSC展現(xiàn)出類似的形態(tài)學(xué)。在第21天，將細(xì)胞固定并用茜素紅染料染色，以觀察通常在骨細(xì)胞中表現(xiàn)出的鈣化。鈣化的存在表明RANKL敲除的MSCs仍然保持其成骨特性分化的能力。
最終，獲得182個(gè)單克隆細(xì)胞，選取17個(gè)做進(jìn)一步驗(yàn)證，獲得2個(gè)成功敲除RANKL基因并表現(xiàn)出增強(qiáng)成骨分化能力的克隆。
參考文獻(xiàn)：
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2.Chen Y , Carlos A. T , Chen L,et al. A Versatile Polypharmacology Platform Promotes Cytoprotection and Viability of Human Pluripotent and Differentiated Cells. Nat Methods. 18(5), 528–541(2021)
3.Vallone et al. Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub-Cloning of Human Pluripotent Stem Cells, Current Protocols in Stem Cell Biology e123, Volume 55(2020)
4.Gross, Tobias, et al. Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and Emulsion Coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning. Plos one 16 3 e0238330 2021.
關(guān)于Cytena公司
Cytena公司潛心研究單細(xì)胞打印機(jī)技術(shù)多年，不斷升級設(shè)備功能，以一貫溫和的分選原理、更加快速的分選效率、更加簡易的操作步驟，助力抗體、細(xì)胞治療、基因治療、干細(xì)胞等研究領(lǐng)域的客戶快速搭建單細(xì)胞篩選平臺。艾貝泰生物科技有限公司作為Cytena的單細(xì)胞打印機(jī)總代理商，為您提供優(yōu)*的售前售后服務(wù)。
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